雙光子激發(fā)熒光(TPEF)顯微鏡，也稱為雙光子顯微鏡，是對(duì)活體組織深層三維成像的首選方法。深度成像是TPEF顯微鏡固有的優(yōu)勢(shì)，它使用了更長(zhǎng)的激發(fā)波長(zhǎng)(通常是近紅外波段)，因而其帶來(lái)的散射比傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡中所使用的較短的可見(jiàn)波長(zhǎng)更少。更長(zhǎng)的波長(zhǎng)同時(shí)也減少了來(lái)自散射光的背景照明，并增加了在更高深度處的對(duì)比度。目前，用TPEF顯微鏡可以獲得1mm深度的體內(nèi)大腦圖像。

在熒光顯微鏡中，當(dāng)兩個(gè)獨(dú)立的光子被一種介質(zhì)同時(shí)吸收時(shí)，就會(huì)發(fā)生雙光子激發(fā)。這需要兩個(gè)合適能量的光子在這樣的介質(zhì)上時(shí)間和空間上同時(shí)重合;通常來(lái)說(shuō)這不需要非常大的激發(fā)光子通量，當(dāng)然光子通量越大， 雙光子同時(shí)被吸收的概率就越大。在TPEF顯微鏡中，更高的光子通量會(huì)帶來(lái)更高的效率，從而帶來(lái)圖像質(zhì)量和分辨率的提升。

在TPEF顯微鏡中，雙光子激發(fā)所需的大光子通量更多的是通過(guò)寬波段可調(diào)諧的鈦寶石飛秒激光器實(shí)現(xiàn)的，激光器典型規(guī)格脈寬為100fs，重復(fù)頻率約為80MHz，這可以給雙光子顯微鏡帶來(lái)非常高的峰值功率和大光子通量。然而，激光器較高的平均功率(在1~4瓦范圍內(nèi))會(huì)由于激發(fā)波長(zhǎng)的線性吸收引起的與介質(zhì)的光熱相互作用而造成熱損傷。這種效應(yīng)在體內(nèi)成像中尤其重要，因?yàn)闇囟瘸^(guò)40oC會(huì)導(dǎo)致不可逆的損傷。因此，傳統(tǒng)的固態(tài)激光器所提供的平均功率必須被衰減才能實(shí)際應(yīng)用于TPEF顯微鏡，峰值功率也會(huì)相應(yīng)地降低。保持較低的平均功率以避免熱損傷，同時(shí)縮短脈沖持續(xù)時(shí)間是一種替代的提高峰值功率的方法。這減少了光子落在介質(zhì)上的時(shí)間間隔，同時(shí)提高了介質(zhì)被吸收的概率。

利用先進(jìn)超連續(xù)譜全光纖激光器技術(shù)得到脈沖寬度短至15fs的商業(yè)激光器。與傳統(tǒng)的100fs激光器相比，SCH的15fs脈沖寬度可在相同平均功率水平下提供超過(guò)傳統(tǒng)飛秒激光器7倍的光子通量。

藍(lán)色線：飛秒激光器光譜曲線;

橙色線：1um波段百秒激光器光譜曲線;

灰色線：紅色熒光蛋白DsRed吸收截面光譜

但是，巨幅提高每個(gè)時(shí)間和面積上可用光子數(shù)量對(duì)圖像的真正影響是什么呢?

一、更高的激發(fā)效率，更高的圖像亮度

理論上，在雙光子顯微鏡中，圖像的亮度與激發(fā)效率直接相關(guān)，而激發(fā)效率完全依賴于光子通量和熒光團(tuán)的二階非線性激發(fā)截面(GM) 。作為一個(gè)例子，我們可以嘗試計(jì)算熒光蛋白mRFP在15fs激光脈寬和1050nm中波長(zhǎng)照射下的激發(fā)效率。與100fs的激光器相比，15fs激光器具有更寬的帶寬(達(dá)200nm)，可以在900到1200nm之間激發(fā)mRFP，與100fs激光器的11nm相比，這是一個(gè)更寬的光譜區(qū)域。

藍(lán)色曲線：以1050nm為中心的15fs全光纖飛秒光纖激光器的峰值功率;

橙色曲線：以1050nm為中心的100fs光纖飛秒激光器的峰值功率;

黑色曲線：mRFP的二階非線性激勵(lì)截面(GM)

考慮到各波長(zhǎng)的峰值功率和激發(fā)截面，可以計(jì)算出mRFP的激發(fā)效率。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)100fs激光器相比較，飛秒激光器15fs的脈沖寬度使得激發(fā)效率提高了50%。

二、多色同時(shí)激發(fā)

想象一下，同時(shí)成像多個(gè)波段范圍的熒光團(tuán)，而不必考慮選擇最佳激發(fā)波長(zhǎng)的激光器。在雙光子顯微鏡中，使用傳統(tǒng)的100fs激發(fā)激光器，這通常是一個(gè)復(fù)雜的，有時(shí)甚至是不可能完成的任務(wù)。傅里葉變換極限的100fs近紅外固體飛秒激光器(例如鈦寶石飛秒激光器、920nm光纖飛秒激光器)的光譜寬度通常在10~20nm范圍內(nèi)，它們只能同時(shí)激發(fā)激發(fā)光譜在10~20nm光譜范圍內(nèi)的熒光團(tuán)。因此，若想用單臺(tái)激光器去同時(shí)激發(fā)更多種類的熒光團(tuán)就需要帶寬更寬，脈沖更短的激光器。

飛秒激光器在提供15fs脈沖寬度的同時(shí)以1050nm為中心波長(zhǎng)提供200nm的帶寬，在這個(gè)帶寬范圍內(nèi) (橫跨900到1200nm)的所有綠色和紅色的熒光團(tuán)都可以同時(shí)被這種激光器激發(fā)。這對(duì)于雙光子顯微鏡來(lái)說(shuō)，同時(shí)對(duì)多個(gè)熒光團(tuán)成像成為一個(gè)可行的，實(shí)用的和簡(jiǎn)單的替代。

常見(jiàn)熒光探針激發(fā)波長(zhǎng)

綜上所述，光纖飛秒激光器激光器，提供15fs的脈沖持續(xù)時(shí)間和一流的高峰值功率(>200kW)，為體內(nèi)樣本的低光損傷激發(fā)提供了強(qiáng)大的工具。結(jié)合全光纖激光器的緊湊性和堅(jiān)固性性，飛秒激光器成為雙光子顯微鏡的特殊激光選擇。